Phyto@Wiki Protocols


※上記の広告は60日以上更新のないWIKIに表示されています。更新することで広告が下部へ移動します。

使用後の実験器具は直ちに片付けること

DNA抽出法 Phenole/Chloroforme法
  • 18 Samples (x19)
海水を1-2L濾過したフィルターを1.5mLチューブに移す

[物理破壊]
TE 260mLをそれぞれ加え、ペッスルでフィルターをすりつぶす。(フィルターは砕けない・・・。)

[タンパク分解;ProteaseK]
TE 200µL,SDS 30µL, ProteaseK 3µLを加え、37℃で1hインキュベート
premix (TE 3.8mL+SDS 0.57mL)から230µL

[細胞壁破壊;凍結融解]
凍結(-80℃)と融解(37℃)を3回繰り返す ----------------------> -80℃で保存可能

[タンパク凝縮;CTAB]
5M NaCl 100µL, CTAB 80µLを加え65℃で10minインキュベート
premix (NaCl 1.9mL+CTAB 1.52mL)から180µL

[タンパク質除去;フェノール/クロロホルム抽出]
PCIx2,CIA(780µL)

[DNA精製;イソプロパノール/エタノール沈殿]
IP,EtOH(780µL)
70%EtOH沈殿(780µL)
TE 57µLに溶かす

[抽出の確認;Agarose gel EP]
5µLを1.5% agarose gelで確認

[濃度計測]
2µLを吸光光度計で濃度計測

[濃度を揃える]
適当な濃度になるようにTEを加える
5本に分注して-80℃で保存(ラベルは白)


Quantification of nucleic acids
  • using UV absorbance at 260 nm, with an absorbance of 1 corresponding to 100 mg of DNA par litter according to equipmet's manual
  • equipmet : Genequant TM (Amersham Pharmacia) with ultramicrocell (5 µl)
  • 簡単、且つ小ボリュームでDNAを計測できる利点がある

[サンプルの準備]
吸光度の計測範囲内の濃度にDNA濃度に希釈する
  • 具体的には吸光度(Absorbance)で0.XXX - 0.0XX(%)
  • 注意点1;セルの容積が小さいため、計測値がばらつくことがあるので共洗いが必要である
  • 注意点2;セルは高価なので、計測面の傷や落下などによる破損に気をつける
  • 注意点3;セルの計測面は汚れがつかないように注意する。汚れた場合は”眼鏡拭き”で拭き取る
  • 主に"Gene quantの取扱説明書"参照
  • 本プロトコルでは -> 「subsample 2 µl of the DNA solution -> dilute the subsample into x10 with the dilution buffer (TE, 18 µl)」の合計20µLを用意

[バックグラウンドの設定]
エタノールからウルトラマイクロセルを取り出して乾かし、セル内を洗浄。
[洗浄手順?]
  • セル内に溶液や空気を通すときは、同じ方向(穴)から通すと、計測誤差が減る
1. セル内の水滴やホコリを空気で飛ばす(air wash)
2. DNAを溶かしているバッファー(c.a.100µL)でピペッティングし、水滴をAir wash(このとき、反対側をキムワイプで受けておく)
3. バッファー(c.a. 70µL)を通しair washを1-2回行う
[?]

バッファー(5-7µL)を空気が入らないように注意してセルに満たす
  • 空気が入っているかどうかのチェックは”黒”を用いてチェックできる(きれいな”円”が見えることを確認する)

"set reference"ボタンを押し、"ピーッ"と音が鳴ったら向きに気をつけてセルを入れる
  • 「"o"の面を手前にする」など、向きを毎回揃えるとばらつきが減る

音が鳴ったらセルを素早く取り出す

バックグラウンドの計測完了

[サンプル計測]
セルを[洗浄?]し、サンプル6µL入れた後、air wash(共洗い)

再度、サンプル6µLをセルに入れ計測

[計測?]
1. "Sample"ボタンを押し、1回音が鳴ると、直ちにセルをセットする
2. 音が鳴ると、セルを直ちに取り出す
3. 計測された吸光度(absorbance)を記録する
4. "select"ボタンで、230、260、280、320nmの吸光度を表示し記録する
[?]

[サンプル計測->計測]を繰り返し

洗浄

スイッチoff
[DNA量の見積もり]
  • 260nmの吸光度(A260)は"x 100[ng/µL]"と換算することができる
  • "A260 x 50[ng/µL]"とする本が多いが、本マイクロセルを用いた場合、は以上のようになる
  • 10倍希釈溶液を用いた場合、"吸光度 x1000"(つまり、表示吸光度値の"0."以下をそのまま)を元のサンプルの濃度とすることができる。

Agarose Electrophresis checking for PCR products consentration
  • 1.5% (g/ml TE) Agarose
[condition]
  • PCR products ... 2µL each
  • Marker 100 bp ... 0.5 µL
  • 40 - 50 min, 100V

[staining]
EtBr (100µL·EtBr/200mL·dH2O)
↓ 15 min staining
dH2O
↓ 15 min destaining
[photo]
photograph with desital camera (mode=Av, F=8.0(minimum),ISO=400)

[mesurment]
Gel-Pro Analyzer(R) Version 4.5 for Windows (TM), 1-demention analysis mode

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electorophoresis)
  • 実験器具は全て実験台の引き出しに保管。使用後は直ちに元の場所に戻すこと
[ゲル作成]
<ガラス板の洗浄>
洗剤→蒸留水で洗浄し、ゲル片や洗剤を取り除く

100%エタノールでガラス表面、スペーサーも拭く(写真A)

スペーサーを挟んだ大小のガラス板をサンドイッチクランプに取り付ける(ガラス板ユニット)
  • ガラス板底辺からスペーサーガ出過ぎないように気をつける
  • パラフィルムを貼付けてゲル漏れを防ぐ(写真B)

ゲル作成用スタンドにガスケットを敷き、ガラス板ユニットをセットする
  • つまみを倒してスタンドにゲル板が固定されたのを確かめる(写真C)
  • ゲルを流し込むためのチューブをビニールテープで付ける

<ゲル試薬の調整>
  • 80%DN(6%AA)と0%DN(6%AA)の2種類のストックAA溶液を混ぜ合わせて、各実験用に「濃いDNAA溶液(HAA)」と「薄いDNAA溶液(LAA)」を作成する
  • HAAとLAAをgradient maker(BioRad)で混ぜ合わせて、LAA%からHAA%の濃度勾配の付いたAAゲルを作成する
次式から、LAAとHAAに必要な80%AA(6%)の体積を算出する
式 ; a x (X/80)
a = ゲルの体積/2
X = 作成したいLAA or HAAの濃度(%)
16 cm x 16 cm x 1mmゲルの場合、容積は32mL
分配をgradient部分=26mL,stacking部分3mLとする(残りはコームの体積)
a = 26/2 = 13
HAA=25%,LAA=75%とするなら、必要な80%AAは
HAA; X = 13 x (75/80) = 11.375 mL (必要な0%AAの体積は、13 - 11.375 = 1.625)
LAA; X = 13 x (25/80) = 4.0625 mL (必要な0%AAの体積は、13 - 4.0625 = 8.9375)

<<primer set;341F-907Rの場合のStandard protocol; 25-70 %DN>>
13mL 25 70 stacking
0%AA 8.9375 1.625 3
80%AA 4.0625 11.375 0
APS 80 80 18 (µL)
TEMED 16.25 16.25 4.5 (µL)
  • TEMEDとAPSは薄いと、ゲルの上部が固まらずに蒸発してしまうため、wellが小さくなる。
  • 逆に多すぎると、作成中にゲルが固まる

50mLチューブに必要なHAAとLAAを作成する
  • HAAに色素(xylencianole)を約10µL入れると作成したゲルの濃度勾配が分かりやすい

Stacking gel 用に0%DN溶液を3mLとる

APS(ammoniumparsulfate;10mg/mL)を"HAAとLAAの[80µL;体積 x 5µL]"加え、vortexする
  • なるべく冷やしておく(冷蔵室へ)
  • stacking gel用DNAA溶液にもAPSを、同じ割合か少し多め加える[18µL;体積 x 6µL]

TEMEDを"HAAとLAAの[16.25µL;体積 x 1.25µL]"加え、vortexする
  • ここから先はゲルが固まり始めるので、高温を避けて無駄無く操作する

シリンジにLAAとHAAをとる

gel makerにセットし、シリンジのチューブをゲル板に取り付けたチューブとつなぐ
  • シリンジとチューブに気泡が入らないように注意し、シリンジとつながっているチューブの先まで溶液を満たしておく

均一な速度でgel makerを操作してゲル板にAA溶液を流し込む
  • 使用後、直ちに蒸留水でシリンジを洗浄する(管内でAAが固まると次回から正しい濃度勾配を造れなくなる)。

ゲル上部の空いたスペースにコームを差し込み、stacking用AA溶液にTEMEDを加えて1mLピペットでゲル上部に静かに流し込む

4時間以上室温におきゲルを固める
[DGGE泳動]
<サンプルアプライ>
コームを抜きウェルを洗浄する
  • 泳動バッファー(TAE)をシリンジに満たして洗浄する

コアユニットにコア用ガスケットを取り付ける
  • ガスケットを忘れるとガラス板が割れるので注意

洗浄したガラス板をコアユニットに取り付ける
  • 一枚でDGGEを行う場合は同様にダミーガラス板をセットする

コアユニットの向きに注意して泳動層にセットし、約15分間温める
  • flowスイッチもonにしてコアユニット上部に泳動バッファーが溜まることを確認
  • 溜まらなければガスケットとガラス板を付け直す

サンプルをウェルにアプライして泳動開始(4〜16時間)

赤黒コネクターをパワーサプライに差し込み、電圧を▽△ボタンでセット後、startを押す
  • コアユニット上部にの白金線がバッファーに浸からないとエラー(Err09)となる
  • その他のエラーは取説参照
[染色&記録保存]
染色液を作成し暗所に保存
  • 染色液; dH2O 80mL + SYBERgold 2µL
  • 水道水は染色効率が悪くなることがあるので使わない

パワーサプライのスイッチをoffにし、赤黒コネクターを抜く

コアユニットを取り出し、ガラス板ユニットを外す

サンプルの順に注意してサンドイッチクランプからガラス板を取り外す

スペーサーとガラス板を外す
  • ガラス板を外す際は"ガラス板分離器"を使用しても良い

ゲルの不要な部分(ウェル部分)を切り取り、表裏とサンプル位置が分かるように目印をつける
  • 例) 右上端をカット

染色液に浸け暗所で約20分間インキュベートする
  • 染色している間に機材を洗浄する

dH2Oに約20分間浸けて余分な染色液を洗い流す

トランスイルミネーターにサランラップを敷く

サンプルの向きに注意してゲルをトランスイルミネーターにおく
  • ゲルとラップの間に気泡が入らないように注意する