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「DGGE for psbA」(2007/10/10 (水) 14:03:37) の最新版変更点

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メモ
AgaroseGel hight = 120 mm @ 36 ppi
DGGE Gel hight = 280 mm @ 36 ppi
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  071002; psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討
&u(){Reference}
-不明
&u(){Protocole}
-不明
&u(){Condition}
-不明
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. .......)

DGGE image
#ref(071002_DGGE_rsa.jpg)
&u(){Comment;Kataoka}
[バンドA;赤色]
-Aで示した3本のバンド(赤色)は目的の2本鎖DNAではない可能性がある。1本差DNAと考えられる。これは、長時間の電気泳動したときにこのバンドの停止位置が変性剤濃度によらないことから確認済。
[バンドB;青色(一部)]
-ウェルのかたちを反映したバンドの形状からしてこちらも、目的のDNAかどうかは不明。
[バンドC;緑色(一部)]
-このバンドが目的のバンド。
Cyanobacteriaのプライマーセット(CYA351-CYA781)で得られたパターンと類似している。得られる塩基配列に期待が持てる。
ただし、(1)バンド位置がゲルの上部に偏っていること、(2)バンドが太いことに関して検討が必要。
[対策]
(1) 一番最初の条件検討としては変性剤濃度勾配の幅が狭い。0-50%の濃度幅で試すことが必要。
(2) (1)を行うことで解決する可能性がある。

全体的にバンドがシャープではなく、バックグラウンドが高い。
-下記のPCR産物のAGP(Agarose Gel Electrophoresis)のバンドの濃さから考えて過剰にapplyされているためにDGGEに最適な解像度が得られていないと考えられる。AGEの濃さと16µLと言うことから考えて(600ng以上かも知れない...)、DGGEの解像度を得るには過剰である。apply量が多い場合にDGGEの解像度が悪くなる例は下記の参考実験を参照。
-AGEの画像解析からPCR産物のDNA濃度(ng/µL)を推定し、段階的に希釈したPCR産物でDGGEを行うことで最適なapply量を決定できる。
-非特異的に増幅されたPCR産物(特に750bp以上の断片)がDGGEのゲル上部のスメアの原因

AGE check
#ref(20071002_PCR.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,Aga=1.5%,time=40min,Et-Br,stain=30min,destain=10min
-photo; degital camera(filter=UV&red,mode=AE, Tv=1, Av=8.0, 測光方式=評価測光, ISO=400, 焦点距離=5.4mm)
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each
-Marker=1µL each
&u(){Comment;Kataoka}
増幅されたバンドについて
-750bpの位置にバンドがあるので目的のpsbA遺伝子領域を増幅できていると考える。
-750bp以上の増幅が大きいことから、PCRによるartifactの増幅が多い。
バンドの濃さについて
-マーカーと比較して750bpのバンドが太く濃いことから、PCRによる増幅は飽和していると考えられる。また、ゲル最下部のプライマによる陰が僕の経験と比べても濃いように思う。
以上のことから、genomeにprimerが着く反応に加えて、genomeもしくは増幅されたPCR産物のprimerサイト同士が着くことでartifactを形成しているかも知れない。
[対策]
750bp以上のサイズの非特異増幅産物が見られること。750bpバンドが濃い(太い)ことから考えてPCRによる増幅は過剰であると考えられる。
-非得意的な増幅を避けるために、PCRサイクル数を減少させることで750bp以上のサイズのバンドが減少することが期待できる。
(Ishii and Fukui 2001; Applied and Environmental microbiology 2001 p3753-3755)
過剰のprimerが残存しているがDGGEへの影響は不明。もしかしたら過剰のprimerはPCR反応中にartifactの原因となるかもしれない。(ただし、推測の域を出ない)
-primerの量を減らすことでartifactの可能性を減らすことができる。
-anniling温度を下げることでprimerのannilingが相対的に増加し、目的の遺伝子部位を増幅する効率が上がるかもしれない。

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参考データ(operated by Tak)
#ref(20060909_1_LR.jpg)
変性剤能動勾配によってバンド位置の決まらない1本鎖DNAと思われるバンドのDGGE中での動き。
-1〜8時間、時間差でDGGEをすると赤矢印以外のバンドは最適な変性剤濃度勾配の位置で停止するが、このバンドは止まらない。
(primer=EUB341F-GC-907R,25-45%DN,6%AA)

#ref(20070314_1189_apply_5.jpg)
DGGEにapplyするDNAの質量(ng)によるバンドの見え方の違い。
-400ngのレーンAは濃く太いバンドが見られる。現れた他のバンドも太くバックグラウンドも高い。
-150-75ngに最適値がある。50ng以下ではバンドとして検出されないものの方が大きくなる。 
レーンB〜Dは同一サンプル、レーンAのみ異なるサンプル。
(primer=EUB341F-GC-907R,6%AA)
  071004; PCR conditionの検討 [psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討]
目的
-PCR conditionを変更して、DGGEに最適なPCR産物を得る。
-071002と比較して、condition変更の成果を確かめる。
&u(){Condition変更点}
-不明

AGE check
#ref(20071004_PCR.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,Aga=1.5%,&u(){time=40min},Et-Br,stain=30min,destain=10min
-photo; degital camera(filter=UV&red,mode=AE, Tv=1, Av=8.0, 測光方式=評価測光, ISO=400, 焦点距離=5.4mm)
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each
-左から、071004PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},M,071002PCRed{No.2,4,6}
-Marker=1µL each
&u(){Comment;Kataoka}
-PCR conditionを変更することで、071001?(右、3 lane)と比べて、鮮明なバンドパターンが得られるようになった(lane2,4,10,12,14,18)。
-lane6,7,16では高分子量の影が見え、さらに、目的とするバンドも太い(オレンジの矢印)。
PCR増幅効率の違いは、サンプルの違いによるものと考える。
DGGEの同一ゲル上で比較する場合はPCR conditionも同じにしておかないと、PCRによる影響が環境の違いを超えてしまう(PCR bias)ので比較することができない。
[対策]
PCR conditionをもう少し検討して、非特異配列が得られたサンプル(オレンジの矢印)で鮮明なAGEバンドを得る。
[ちなみに....]
-「不明」と書いてあるところを埋めて下さい
-Mupidの比較実験はしていません。Meetingでも言いましたが昨日の結果から、電気泳動は支障ないと考えられます。おそらく、マーカーが原因
-昨日の結果を見せて下さい。
-PCR productsのPCR増幅を揃えないとDGGEによる比較はできませんが、時間が無いようでしたら「apply量」と「変性剤濃度幅」の試験は今日のサンプルを使ってできると思います。
-DGGEの電圧と泳動時間を変えることについて。条件は「200V,4h,x0.5 TAE」を基本プロトコルとして行いたいと考えています。詳細は後日伝えますが、もし、DGGE分解能が足りないときにのみ試しましょう。

  071009; PCR conditionの検討 [psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討]-apply量とDN濃度幅の検討-
-071002のDGGEから(1)高バックグラウンドと(2)不適切なDN濃度幅(狭い)であったので、&u(){DNAのapply量を減らす(1)}、&u(){DN濃度幅を広げる(2)}ことで改善を図った。
  
DGGE image
#ref(071002-10_DGGE_rsa.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,AA=6%,&u(){time=4 h},Syber gold,stain=?? min,destain=?? min
-photo; degital camera
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...)
-左から、07100x PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},&u(){47〜100 ng}
&u(){Comment;Kataoka}
DNA apply量
-100ngに減らすことでより鮮明なバンドパターンが得られた。
-各レーンで揃えることで、サンプル(Stn.)間の違いが見やすくなった。
-レーン6,8,16がスメアであるが、これらのサンプルはAEPでも高分子量領域にスメアな影が見える結果と対応しており、PCRによるartifactであると考えられる。
-apply量を減らすことでノイズと考えられた、071002-DGGEの青矢印で見られた影が消えた。
-一本鎖と思われたバンドが消え、バンドパターンの鮮明さが改善された。僕の経験からもapply量が過剰であればあるほど一本鎖と考えられるバンドの影が邪魔になります。これは、最適DN濃度を持たない一本鎖は分子量により泳動されるのでDN濃度勾配によって分散しないためと考えています。
DN濃度幅
-バンドの位置が全体的に下がり見やすくなった。ただし、ゲル上部にバンドの様な影が見えることからDN 0-80%で一度試しておく良いかもしれない。
-一本鎖と思われたバンド(赤矢印)は泳動条件(time,buffer,AA濃度)が変わらないので、DN濃度が変わったのにも関わらず、ほとんど同じ位置にあります。
-一方、緑矢印で示したバンドは変性剤の濃度幅が変わったことに対応してゲル下方へ移動しています。
[対策]
-100ngでもバンドがぼやけており、まだ、DNA量が多いかも知れません。100,75,50,25...ngと段階的に変化させてみることで適切な量が分かるかもしれません。
-AEPで見る限りPCRは良くなってきました。しかし、バンドがぼやけるのはDGGE condition(buffer濃度,AA%)とPCR condition(非得意的増幅,増幅領域)両方の可能性があります。とりあえず一つずつ解決していきましょう。引き続きPCR AEPのバンドが全てのサンプルで一本になるように条件検討を続けて下さい。
[ちなみに]
-1xTAEで実験をしていますが、200V,4hでDGGEをするときは0.5xTAEで行うようにして下さい。他の実験と比較するため。
-クランプを締めすぎたからと言って、バンドが不鮮明になることはありません。不鮮明な理由は上記のことが考えられます。

AGE check
#ref(071009_psbA_PCR12_0.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,Aga=1.5%,&u(){time=40min},&u(){Syber gold;stain= ?? min,destain = ?? min}
-photo; degital camera
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each
-左から、M,071004PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},M
-Marker= 1?? µL each
[ちなみに]
-Syber goldでも綺麗な写真が撮れるようになったね。どうやったか教えて下さい。
-Markerが不鮮明なのはMarkerに問題がありそうです。例えば、薄めることが悪いとか。。。

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メモ
AgaroseGel hight = 120 mm @ 36 ppi
DGGE Gel hight = 280 mm @ 36 ppi
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  071002; psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討
&u(){Reference}
-不明
&u(){Protocole}
-不明
&u(){Condition}
-不明
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. .......)

DGGE image
#ref(071002_DGGE_rsa.jpg)
&u(){Comment;Kataoka}
[バンドA;赤色]
-Aで示した3本のバンド(赤色)は目的の2本鎖DNAではない可能性がある。1本差DNAと考えられる。これは、長時間の電気泳動したときにこのバンドの停止位置が変性剤濃度によらないことから確認済。
[バンドB;青色(一部)]
-ウェルのかたちを反映したバンドの形状からしてこちらも、目的のDNAかどうかは不明。
[バンドC;緑色(一部)]
-このバンドが目的のバンド。
Cyanobacteriaのプライマーセット(CYA351-CYA781)で得られたパターンと類似している。得られる塩基配列に期待が持てる。
ただし、(1)バンド位置がゲルの上部に偏っていること、(2)バンドが太いことに関して検討が必要。
[対策]
(1) 一番最初の条件検討としては変性剤濃度勾配の幅が狭い。0-50%の濃度幅で試すことが必要。
(2) (1)を行うことで解決する可能性がある。

全体的にバンドがシャープではなく、バックグラウンドが高い。
-下記のPCR産物のAGP(Agarose Gel Electrophoresis)のバンドの濃さから考えて過剰にapplyされているためにDGGEに最適な解像度が得られていないと考えられる。AGEの濃さと16µLと言うことから考えて(600ng以上かも知れない...)、DGGEの解像度を得るには過剰である。apply量が多い場合にDGGEの解像度が悪くなる例は下記の参考実験を参照。
-AGEの画像解析からPCR産物のDNA濃度(ng/µL)を推定し、段階的に希釈したPCR産物でDGGEを行うことで最適なapply量を決定できる。
-非特異的に増幅されたPCR産物(特に750bp以上の断片)がDGGEのゲル上部のスメアの原因

AGE check
#ref(20071002_PCR.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,Aga=1.5%,time=40min,Et-Br,stain=30min,destain=10min
-photo; degital camera(filter=UV&red,mode=AE, Tv=1, Av=8.0, 測光方式=評価測光, ISO=400, 焦点距離=5.4mm)
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each
-Marker=1µL each
&u(){Comment;Kataoka}
増幅されたバンドについて
-750bpの位置にバンドがあるので目的のpsbA遺伝子領域を増幅できていると考える。
-750bp以上の増幅が大きいことから、PCRによるartifactの増幅が多い。
バンドの濃さについて
-マーカーと比較して750bpのバンドが太く濃いことから、PCRによる増幅は飽和していると考えられる。また、ゲル最下部のプライマによる陰が僕の経験と比べても濃いように思う。
以上のことから、genomeにprimerが着く反応に加えて、genomeもしくは増幅されたPCR産物のprimerサイト同士が着くことでartifactを形成しているかも知れない。
[対策]
750bp以上のサイズの非特異増幅産物が見られること。750bpバンドが濃い(太い)ことから考えてPCRによる増幅は過剰であると考えられる。
-非得意的な増幅を避けるために、PCRサイクル数を減少させることで750bp以上のサイズのバンドが減少することが期待できる。
(Ishii and Fukui 2001; Applied and Environmental microbiology 2001 p3753-3755)
過剰のprimerが残存しているがDGGEへの影響は不明。もしかしたら過剰のprimerはPCR反応中にartifactの原因となるかもしれない。(ただし、推測の域を出ない)
-primerの量を減らすことでartifactの可能性を減らすことができる。
-anniling温度を下げることでprimerのannilingが相対的に増加し、目的の遺伝子部位を増幅する効率が上がるかもしれない。

----

参考データ(operated by Tak)
#ref(20060909_1_LR.jpg)
変性剤能動勾配によってバンド位置の決まらない1本鎖DNAと思われるバンドのDGGE中での動き。
-1〜8時間、時間差でDGGEをすると赤矢印以外のバンドは最適な変性剤濃度勾配の位置で停止するが、このバンドは止まらない。
(primer=EUB341F-GC-907R,25-45%DN,6%AA)

#ref(20070314_1189_apply_5.jpg)
DGGEにapplyするDNAの質量(ng)によるバンドの見え方の違い。
-400ngのレーンAは濃く太いバンドが見られる。現れた他のバンドも太くバックグラウンドも高い。
-150-75ngに最適値がある。50ng以下ではバンドとして検出されないものの方が大きくなる。 
レーンB〜Dは同一サンプル、レーンAのみ異なるサンプル。
(primer=EUB341F-GC-907R,6%AA)
  071004; PCR conditionの検討 [psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討]
目的
-PCR conditionを変更して、DGGEに最適なPCR産物を得る。
-071002と比較して、condition変更の成果を確かめる。
&u(){Condition変更点}
-不明

AGE check
#ref(20071004_PCR.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,Aga=1.5%,&u(){time=40min},Et-Br,stain=30min,destain=10min
-photo; degital camera(filter=UV&red,mode=AE, Tv=1, Av=8.0, 測光方式=評価測光, ISO=400, 焦点距離=5.4mm)
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each
-左から、071004PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},M,071002PCRed{No.2,4,6}
-Marker=1µL each
&u(){Comment;Kataoka}
-PCR conditionを変更することで、071001?(右、3 lane)と比べて、鮮明なバンドパターンが得られるようになった(lane2,4,10,12,14,18)。
-lane6,7,16では高分子量の影が見え、さらに、目的とするバンドも太い(オレンジの矢印)。
PCR増幅効率の違いは、サンプルの違いによるものと考える。
DGGEの同一ゲル上で比較する場合はPCR conditionも同じにしておかないと、PCRによる影響が環境の違いを超えてしまう(PCR bias)ので比較することができない。
[対策]
PCR conditionをもう少し検討して、非特異配列が得られたサンプル(オレンジの矢印)で鮮明なAGEバンドを得る。
[ちなみに....]
-「不明」と書いてあるところを埋めて下さい
-Mupidの比較実験はしていません。Meetingでも言いましたが昨日の結果から、電気泳動は支障ないと考えられます。おそらく、マーカーが原因
-昨日の結果を見せて下さい。
-PCR productsのPCR増幅を揃えないとDGGEによる比較はできませんが、時間が無いようでしたら「apply量」と「変性剤濃度幅」の試験は今日のサンプルを使ってできると思います。
-DGGEの電圧と泳動時間を変えることについて。条件は「200V,4h,x0.5 TAE」を基本プロトコルとして行いたいと考えています。詳細は後日伝えますが、もし、DGGE分解能が足りないときにのみ試しましょう。

  071009; PCR conditionの検討 [psbAプライマーを使ったDGGE解析の条件検討]-apply量とDN濃度幅の検討-
-071002のDGGEから(1)高バックグラウンドと(2)不適切なDN濃度幅(狭い)であったので、&u(){DNAのapply量を減らす(1)}、&u(){DN濃度幅を広げる(2)}ことで改善を図った。
  
DGGE image
#ref(071002-10_DGGE_rsa.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,AA=6%,&u(){time=4 h},Syber gold,stain=?? min,destain=?? min
-photo; degital camera
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...)
-左から、07100x PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},&u(){47〜100 ng}
&u(){Comment;Kataoka}
DNA apply量
-100ngに減らすことでより鮮明なバンドパターンが得られた。
-各レーンで揃えることで、サンプル(Stn.)間の違いが見やすくなった。
-レーン6,8,16がスメアであるが、これらのサンプルはAEPでも高分子量領域にスメアな影が見える結果と対応しており、PCRによるartifactであると考えられる。
-apply量を減らすことでノイズと考えられた、071002-DGGEの青矢印で見られた影が消えた。
-一本鎖と思われたバンドが消え、バンドパターンの鮮明さが改善された。僕の経験からもapply量が過剰であればあるほど一本鎖と考えられるバンドの影が邪魔になります。これは、最適DN濃度を持たない一本鎖は分子量により泳動されるのでDN濃度勾配によって分散しないためと考えています。
DN濃度幅
-バンドの位置が全体的に下がり見やすくなった。ただし、ゲル上部にバンドの様な影が見えることからDN 0-80%で一度試しておく良いかもしれない。
-一本鎖と思われたバンド(赤矢印)は泳動条件(time,buffer,AA濃度)が変わらないので、DN濃度が変わったのにも関わらず、ほとんど同じ位置にあります。
-一方、緑矢印で示したバンドは変性剤の濃度幅が変わったことに対応してゲル下方へ移動しています。
[対策]
-100ngでもバンドがぼやけており、まだ、DNA量が多いかも知れません。100,75,50,25...ngと段階的に変化させてみることで適切な量が分かるかもしれません。
-AEPで見る限りPCRは良くなってきました。しかし、バンドがぼやけるのはDGGE condition(buffer濃度,AA%)とPCR condition(非得意的増幅,増幅領域)両方の可能性があります。とりあえず一つずつ解決していきましょう。引き続きPCR AEPのバンドが全てのサンプルで一本になるように条件検討を続けて下さい。
[ちなみに]
-1xTAEで実験をしていますが、200V,4hでDGGEをするときは0.5xTAEで行うようにして下さい。他の実験と比較するため。
-クランプを締めすぎたからと言って、バンドが不鮮明になることはありません。不鮮明な理由は上記のことが考えられます。

AGE check
#ref(071009_psbA_PCR12_0.jpg)
&u(){Condition}
-1xTAE,Aga=1.5%,&u(){time=40min},&u(){Syber gold;stain= ?? min,destain = ?? min}
-photo; degital camera
&u(){Samples}
-KH0605,1-9(Stn. ...不明...),2µL each
-左から、M,071004PCRed{No.2,4,6,8,10,12,14,16,18},M
-Marker= 1?? µL each
[ちなみに]
-Gel 1とGel 2の違いを教えて下さい。ゲルやサンプルを少しくらい放置していてもコンタミが無い限り結果に影響はありません。Gel1とGel2の両方ともとても綺麗な結果だと思います。
-Syber goldでも綺麗な写真が撮れるようになったね。どうやったか教えて下さい。
-Markerが不鮮明なのはMarkerに問題がありそうです。例えば、薄めることが悪いとか。。。